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卵磷脂的提取与鉴定一试验目的了解用乙醇作为溶剂提取卵磷脂的do

发布时间:2019-06-12 09:29 来源:未知 编辑:admin

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  卵磷脂的提取与鉴定 一 实验目的 了解用乙醇作为溶剂提取卵磷脂的原理和方法。 二 实验原理 卵磷脂在脑神经细胞中含量很高,蛋黄中含有特别高。根据卵磷脂溶于乙醇、等有机溶剂进行提取。新提取的卵磷脂为白色蜡状物,与空气接触后被氧化为黄褐色。利用卵磷脂的胆碱基在碱性溶液中可以分解为三甲胺(特殊的鱼腥臭味)进行鉴别。 三 实验器材与试剂 鸡蛋黄、乙醇(95%)、10%NaOH、烧杯、量筒等。 四 实验步骤 1 提取卵磷脂 取2g蛋黄于15mL(95%)乙醇,过滤、蒸气浴蒸干,残留物为卵磷脂。 2 鉴别 取少量的卵磷脂于试管中,加10%NaOH溶液2mL,水浴加热是否产生鱼腥臭味。 五 注意事项 滤液要清。 六 作业 完成实验报告,写出实验小结。 粗脂肪的提取和定量测定——索氏提取法 一 实验目的 1 学习和掌握用索氏提取器提取脂肪的原理和方法 2 学习和掌握用重量分析法对粗脂肪进行定量测定。 二 实验原理 利用脂类物质溶于有机溶剂的特性,在索氏提取器中用有机溶剂对样品中的的脂类物质进行提取。因提取的物质是脂类物质的混合物,故称其为粗脂肪。 三 实验器材 1索氏提取器 2 分析天平 3 烧杯 4 恒温水浴锅 5 脱脂棉和脱脂滤纸 6 镊子 7 干燥器 四 实验试剂与材料 1 样品 2 石油醚 五 实验步骤 1称量索氏提取瓶 将索氏提取瓶洗净烘干至恒重,记录重量。 2提取样品粗脂肪 将石油醚加到提取瓶内约为瓶容积1/2—2/3。将样品包放入提取管内。连接索氏提取器各个部分。用70度-80度恒温水浴加热提取瓶,抽提进行2―3小时,直至提取管内的石油醚用滤纸检验无油迹为止,表示提取完全。 3 计算样品中粗脂肪的含量 提取完毕,取出滤纸包,再回馏一次,倒出石油醚。取下提取瓶,洗净瓶的外壁,烘干至恒重。记录重量。 按照下式计算样品中粗脂肪的百分含量。 粗脂肪(%)=(提取后提取瓶的重量-提取前提取瓶的重量)/样品重量*100% 六 作业 计算样品中粗脂肪的含量,完成实验报告。 思考题: 做好本实验应注意哪些事项? 氨基酸的分离鉴定――纸层析法通过氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法。 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的:Rf = 原点到层析中心的距离 / 原点到容剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸1、层析缸2、毛细管3、喷雾器4、培养皿5、层析滤纸(新华一号)1、扩展剂650mL) 是4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20 mL正丁醇和5 mL冰醋酸放人分液漏斗中,与15mL水混合,充分振荡,静置后分层,放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂,其余的倒人培养皿中备用。2、氨基酸溶液0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0.5%)各5mL3、显色剂 50~lOOmL%水合茚三酮正丁醇溶液。1、将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。2、取层析滤纸(长22 cm、宽14 cm)一张。在纸的一端距边缘2~3 cm处用铅笔划一条直线、点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上,干后再点一次。每点在纸上扩散的直径,最大不超过3 mm。4、扩展用线将滤纸缝成筒状,纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中,并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面需低于点样线 cm时即取出滤纸,铅笔描出溶剂前沿界线,自然干燥或用吹风机热风吹干。5、显色 用喷雾器均匀喷上0。1%茚三酮正丁醇溶液,然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。6、计算各种氨基酸的Rf值。计算各种氨基酸的Rf值、何谓纸层析法?2、何谓及f值?影响只f值的主要因素是什么?3、怎样制备扩展剂?4、层析缸中平衡溶剂的作用是什么? 清蛋白 球 蛋 白 α1 α2 β γ 等 电 点 4.88 5.06 5.06 5.06 6.85-7.3 分子量(万) 6.9 20 30 9-15 15.6-30 其电泳图谱如下 清蛋白 α1 α2 β γ 点样 三 实验器材 1.试管及试管架; 2.刻度吸管或移液器;3.微量加样器(或1×5㎝ 胶片); 4.培养皿;5.染色缸、洗脱缸; 6.剪刀、镊子;7. 滤纸;8.醋酸纤维素薄膜;9.电泳仪;10. 723 分光光度计。 四 实验试剂 1. 巴比妥缓冲液(pH 8.6): 称取巴比妥钠 15.458g和巴比妥 2.768 g,溶于 1000 ml蒸馏水中。 2. 氨基黑10B 染色液:取氨基黑10B 0.5g,加冰醋酸10ml 及甲醇50ml ,混匀,用蒸馏水稀释至100ml。 3. 洗脱液: 取95 % 乙醇 45ml,加冰醋酸 5ml,混匀,用蒸馏水稀释至 100ml。 4. 0.4mol/L NaoH 溶液。 五 实验步骤 1.检查电泳仪:检查电源是否连好,电泳仪与电泳槽的电极连接是否正确,注意正负极不要接错。 2.点样:洗净手,从巴比妥缓冲液中取2.5×8㎝ 醋酸纤维薄膜(提前一小时浸入,已编好号)一条,夹于滤纸中,轻轻吸去多余的缓冲液。将薄膜毛面向上,用微量加样器或胶片蘸取适量血清(约2~3微升,过多会影响分离),垂直均匀地点在距膜端1.5㎝ 划线处,待血清全部渗入膜内后,将加样器或胶片拿开。 3.电泳: 将点好样的薄膜毛面向下(以防水份蒸发干燥),置电泳槽滤纸联桥上(薄膜应放正,否则电泳图谱不整齐),点样端为阴极端,平衡5分钟。接通电源,调节电压10~15v/cm长,电流0.4~0.6mA/cm宽,通电60分钟。 4.染色:关闭电源:取出薄膜,浸入氨基黑10B染色液中10分钟。 5.洗脱:在三个洗脱缸中,依次浸泡,每次约10分钟,直到背景无色,区带清晰为止,取出晾干。然后根据电泳标准图辨认各蛋白质区带。 6.测定:将各区带剪下,置于相应标记的大试管中,同时在该薄膜上的空白处(应无任何污染),剪下一条与α1-球蛋白面积形状相近的区带,置于一大试管中,作为空白对照。然后每管加0.4mol/L NaOH 4ml,不断振摇30分钟,使染色的蛋白浸出,用620nm波长进行比色,以空白调零点,测各管吸光度。 [计算] 各蛋白质区带洗脱液的吸光度 ×100 =各蛋白质占血清蛋白总量的百分率(%) 各蛋白质区带洗脱液吸光度总和 [正常值] 白蛋白: 67~73% α1-球蛋白: 3~4%; α2-球蛋白: 5~9%; β-球蛋白: 6~9%; γ-球蛋白: 11~14%; 附:光密度计法定量: 将干燥的蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳图谱放入自动扫描光密度仪(或色谱扫描仪)内,通过反射(用未透明薄膜)或透射(用已透明的薄膜)方式,在记录器上自动绘出蛋白质各组分曲线图,横坐标为膜的长度,纵坐标为光密度,每一个峰代表一种蛋白质组分。然后用求积仪测量出各峰的面积,计算每个峰的面积与它们的总面积的百分比就代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。在使用具有电子计算机附件的自动扫描光密度仪时,可以从数字显示部分或打字带上直接获得每条区带蛋白质百分含量。 六 作业 完成实验报告 思考题: 1.血清蛋白质的电泳分析有何临床意义? 2.一蛋白质等电点为pH 4.88,而另一蛋白质等电点为pH 9.4,它们在pH 8.6的缓冲液中应带什么电荷? 在电场中的电泳方向如何? 蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 (一)双缩脲反应1、原理?? 尿素加热至180℃左右,生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物,此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键,其结构与双缩脲相似,也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应,但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。2.试剂(1)尿素(2)10%氢氧化钠溶液(3)1%硫酸铜溶液(4)2%卵清蛋白溶液3.操作??(1)取少量尿素结晶,放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时,停止加热,尿素放出氨,形成双缩脲。冷后,加10%氢氧化化钠溶液约1ml,振荡混匀,再加1%硫酸铜溶液1滴,再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜,否则,生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml,摇匀,再加1%硫酸铜溶液2滴,随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。(二)茚三酮反应1.原理?? 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外,所有α―氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。β―丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此,虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应,但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中,应严防干扰物存在。该反应十分灵敏,1:1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应,是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步,第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,水合茚三酮被还原成型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为5~7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同,酸度过大时甚至不显色。2.试剂(1)蛋白质溶液????????????????? 100ml?2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清:水=1:9)(2)0.5%甘氨酸溶液(3)0.1%茚三酮水溶液(4)0.1%茚三酮-乙醇溶液3、操作(1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml,再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液,混匀,在沸水浴中加热1~2分钟,观察颜色由粉色变紫色再变蓝。(2)在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液,风干后,再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察紫红色斑点的出现。(三)黄色反应1、原理?? 含有苯环结构的氨基酸,如酷氨酸和色氨酸,遇硝酸后,可被硝化成黄色物质,该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸,所以有黄色反应,苯丙氨酸不易硝化,需加入少量浓硫酸才有黄色反应。2、试剂(1)鸡蛋清溶液?????????????????????????????? 100ml将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1:20混匀,然后用6层纱布过滤。(2)大豆提取液?????????????????????????????? 100ml(3)头发(4)指甲(5)0.5%苯酚溶液????????????????????????????? 50ml(6)浓硝酸??????????????????????????????????? 200 ml(7)0.3%色氨酸溶液???????????????????????????? 10 ml(8)0.3%酪氨酸溶液???????????????????????????? 10 ml(9)10%氢氧化钠溶液?????????????????????????? 100 ml3、操作?? 向7个试管中分别按下表加入试剂,观察各管出现的现象,有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后,于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性,观察颜色变化。 号 1 2 3 4 5 6 7 材 料 (滴) 鸡蛋清 溶液 4 大豆 提取液 4 指甲 ? 少许 头发 ? 少许 0.5% 苯酚 4 0.3% 色氨酸 4 0.3% 酪氨酸 4 浓硝酸/(滴) 2 4 40 40 4 4 4 现象 ? ? ? ? ? ? ? 三 作业 完成实验报告,写出实验小结。 蛋白质的沉淀及变性 一 实验目的:1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 2、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 3、了解变性与沉淀的关系 原理:正常状态下,Pr分子表面具有水化膜和双电层,能保持其胶体溶 液的稳定性,在一定因素的影响下,Pr会失去电荷和脱水沉淀。 蛋白质的变性与沉淀之间没有必然联系 操作: ?盐析:卵球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中析出,清蛋白在饱和硫酸铵溶液中析出。???????????????? 四? 注意事项:1、沉淀的出现多种多样2、节约试剂 结果与分析:记录实验现象并分析结果 (活化能的关系),每升高10℃,反应速度加快一倍(发烧的生理作用是提高机体内的有限的酶分子的活性,以发挥其最大效用);但酶是蛋白质,温度过高可导致其变性失活。动物酶的最适温度:37-40℃;植物酶的最适温度:50-60℃。低温可降低/抑制酶活性,但不会使其失活。 酶的活力受环境pH的影响极为显著。酶通常只在其最适pH范围内才表现最大活性。因为酶是蛋白质,而蛋白质在不同pH条件下其分子的情况(如带电状况、分子形状等)是不一样的。所以,某一pH 条件才最适合于具有空间构象的酶表现其最大活性。( 本实验使用的唾液淀粉酶的最适pH为6.8。) 酶是具有特殊的构象,只有保持其构象才具有活性。而某些因素可以影响(调整)酶的这种构象——或使酶活性增加(激活剂),或使酶活性降低/丧失(抑制剂)。在本实验中,NaCl中的Cl是淀粉酶的激活剂,CuSO4 中的 Cu2+是淀粉酶的抑制剂。 淀粉酶水解淀粉;蔗糖酶水解蔗糖,具有专一性。在本实验中,结果是由 Benedict试剂检验的:向被检溶液中加少量Benedict试剂,混匀,放在沸水浴中煮沸 2-3 分钟。产生红黄色沉淀为阳性反应。 三 实验器材与试剂 器材:试管及试管架,恒温水浴锅,冰浴,沸水浴,吸管,50mL的锥形瓶等。 试剂:0.2%淀粉的0.3% NaCl溶液,稀释200倍的唾液,KI-I溶液,0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液,0.1 mol/L 柠檬酸溶液,0.1% NaCl溶液, 1% NaCl溶液,1% 硫酸铜溶液,1% 硫酸钠溶液,2%蔗糖溶液,Benedict试剂等。 四 实验步骤 1.温度对酶促反应的影响 (1)取3支试管,编号,每管各加入PH6.8缓冲液20滴,1%淀粉10滴。 (2)将第一管放入37℃恒温水浴中,第二管放入沸水浴中,第三管放入冰浴中。 (3)各管放置5分钟后,分别加稀释唾液5滴,再放回原处。 (4)放置10分钟后取出,分别向各管加入稀碘液1滴,观察3管中颜色的区别,说明温度对酶促反应的影响。 2.PH对酶促反应的影响 (1)取3支试管,编号。按下表加入试剂。 管序 缓冲液 缓冲液 缓冲液 淀粉溶液 1% 稀唾液 PH3.0 PH6.8 PH8.0 1 20滴 — ? 10滴 5滴 2 — 20滴 ? 10滴 5滴 3 — ? 20滴 10滴 5滴 (2)将上面各管摇匀放入37℃恒温水浴中保温。 (3)5~10分钟后,取出分别加入1滴稀碘溶液,观察3管颜色的区别,说明PH对酶促反应的影响。 3.激活剂与抑制剂对酶促反应的影响 (1)取4支试管,编号按下表加入试剂。 管序 缓冲液 淀粉溶液 蒸馏水 NaCl CuSO4 Na2SO4 1% 稀唾液 PH6.8 1% 1% 1% 1 20滴 10滴 10滴 — — — 5滴 2 20滴 10滴 — 10滴 — — 5滴 3 20滴 10滴 — — 10滴 — 5滴 4 20滴 10滴 — — — 10滴 5滴 (2)摇匀各管放入37℃恒温水浴中保温。 (3)5~10分钟后,取出分别加入稀碘溶液1滴,观察各管颜色的区别,说明激活剂与抑制剂对酶促反应的影响。讨论该实验设计第4管是何目的?该管应与哪管颜色相同? 4.酶专一性 (1)淀粉酶的专一性 管 号 1 2 3 4 5 6 1%淀粉溶液(滴) 4 - 4 - 4 - 2%蔗糖溶液(滴) - 4 - 4 - 4 稀释唾液(mL) - - 1 1 - - 煮沸过的稀释唾液(mL) - - - - 1 1 蒸馏水(mL) 1 1 - - - - 37℃恒温水浴15min Benedict试剂(mL) 1 1 1 1 1 1 沸水浴2-3min 现 象 (2)蔗糖酶的专一性 管 号 1 2 3 4 5 6 1%淀粉溶液(滴) 4 - 4 - 4 - 2%蔗糖溶液(滴) - 4 - 4 - 4 蔗糖酶溶液(mL) - - 1 1 - - 煮沸的蔗糖酶溶液(mL) - - - - 1 1 蒸馏水(mL) 1 1 - - - - 37℃恒温水浴5min Benedict试剂(mL) 1 1 1 1 1 1 沸水浴2-3min 现 象 解释实验结果。 五 作业 1完成试验报告 2分析与思考:通过实验,说明酶促反应怎样受到温度、pH、激活剂与抑制剂的影响。 血液中葡萄糖的测定 一 实验目的 掌握邻甲苯胺法测定血清葡萄糖的原理和方法 二 实验原理 葡萄糖在热的醋酸溶液中脱水后与邻甲苯胺缩合,生成蓝绿色醛亚胺,邻甲苯胺对葡萄糖特异性高,而且不用去掉蛋白质,优越于Foliin-Wu氏法。邻甲苯胺试剂只与醛糖作用,对于其它还原物质都不反应,没有干扰。 三 实验试剂及材料 1.实验材料? 新鲜血清 ?? 2.仪器 ??? (1)试管、试管架、吸量管 ??? (2)水浴锅 ??? (3)721分光光度计 ??? 3.试剂??? ??? (1)邻甲苯胺试剂:称取硫脲2.5g,溶解于750mL冰醋酸中,再将此溶液移入1000mL容量瓶内,加邻甲苯胺150mL及2.4%硼酸100mL,加冰醋酸至刻度。置棕色瓶中,至少可用2个月。 ??? (2)葡萄糖贮存标准液(10mg/mL):称取2g左右葡萄糖置于硫酸干燥器内过夜,精确称取葡萄糖1.00g,以饱和苯甲酸溶解,移入100mL容量瓶内,再以饱和苯甲酸稀释至刻度。 四 实验步骤 l制作标准曲线个,分别编号,依次加入葡萄糖贮存标准液0.5、1.0、2.O、3.O、4.0mL。再以饱和苯甲酸溶液稀释至10mL刻度,混匀。取O.1mL稀释液,葡萄糖含量分别为50、100、200、300、400μg。然后按下表操作: 试 管 试 剂(ml) 0 ? ??? 1 ? ??? 2 ? ??? 3 ? ??? 4 ? ??? 5 ? ? 邻甲苯胺试剂 ??? 5.O ??? 5.0 ??? 5.O ??? 5.0 ??? 5.0 ??? 5.0 稀释葡萄糖标准液 ? 0.0 ??? 0.1 ??? 0.1 ??? 0.1 ??? 0.1 ??? 0.1 ??? 蒸馏水 ? ??0.1 ? ? ? ? ? ?? 混匀后,置沸水浴中煮沸15min,取出于冷水中冷却,在630nm处比色。以光密度为纵坐标,葡萄糖含量为横坐标,绘制标准曲线支,注明测定管和空白管,按下表操作: 管? 别 试 剂(ml) 测定管 空白管 邻甲苯胺试剂 5.0 5.0 血清 0.1 ?0.0 蒸馏水 0.0? 0.1 ??混匀后,置沸水浴中煮沸15min,冷却,在630nm处比色。从标准曲线查出待测血清的葡萄糖含量。 五 作业 完成实验报告,写出实验小结。 ??? ? 果实品质指标的判断―― (一)可溶性总糖的提取与测定--蒽酮比色法 一 实验目的 1 学习蒽酮比色定糖的原理和方法 2 学习723型分光光度计的原理和操作方法 二 实验原理 糖在较高的温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糠醛的衍生物后与蒽酮缩合成蓝色的化合物。溶液含糖量在每毫升150ug以内,与蒽酮反应生成颜色深浅与糖量成正比。 三 实验器材 试管,移液管,三角瓶,沸水浴,冰浴,723型分光光度计 四 实验试剂和材料 1 蒽酮试剂(100mg/100mL) 2 葡萄糖标准溶液(100ug/mL) 3 样品溶液:自选样品,本实验以梨为材料。 五 实验步骤 1 制作标准曲线支干燥洁净的试管,编号后按下表操作。 编号试剂 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖标准液 (100ug/mL) H2O 蒽酮试剂 0 1.0 10 0.10 0.90 10 0.20 0.80 10 0.30 0.70 10 0.40 0.60 10 0.60 0.40 10 0.80 0.20 10 每管加入葡萄糖标准溶液和水后立即混匀,迅速置于冰浴中,待各管都加入蒽酮试剂后,同时置于沸水浴中,准确加热7分钟,立即取出置于冰浴中冷却。待各管溶液达到室温后,于分光光度计比色。以第一管为空白,迅速测其余各管的光吸收值。然后各管溶液含糖量ug数为横坐标,吸光度为(A620)为纵坐标,画出相关标准曲线。 测定样品含糖量 取4支试管按下表操作。 编号 试剂 1 2 3 4 样品溶液 H2O 蒽酮试剂 0 1.0 10 1.0 0 10 1.0 0 10 1.0 0 10 其他操作与制作标准曲线的平均值,根据平均值从标准曲线上查出含糖ug数,再换算成100g样品中总糖的含量。 六 作业 画出标准曲线g样品含糖量。 思考题:用蒽酮比色法测定样品中糖含量时,应注意什么? 为什么? (二)维生素 C 的测定--磷钼酸法 一 实验目的 了解Vc的测定方法,加深理解Vc的理化性质。 二 实验原理 钼酸铵在一定的条件下与Vc反应生成蓝色结合物。在一定浓度范围吸光值与浓度呈直线关系。此实验优点:无干扰,专一性好并且反应迅速。 三 实验器材与试剂 富含Vc的生物材料,分光光度计,水浴锅,离心机等 5% 钼酸胺,草酸-EDTA,硫酸,冰乙酸,标准Vc溶液等 四 操作过程 1 制作标准曲线支试管,按下标操作。 管 号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 标准Vc液(0.25mg/ml)ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/ml 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.2 0 草酸-EDTA/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 偏磷酸-乙酸/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 1:19硫酸 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 5% 钼酸铵/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 摇匀30度水浴15min Vc质量/ug 0 25 50 75 100 125 150 200 250 A760nm 30度水浴15min后,测定。以吸光度值为纵坐标,Vc的质量为横坐标作图。 2 样品测定 准确称取样品1g,加入提取液,组织捣碎匀浆,离心(4000r/min)5min。取上清液1ml。按标准曲线做,根据吸光值查维生素C的含量。 五 实验结果 计算100g所含维生素C的质量。 六 作业 完成实验报告。 (三)蛋白质提取及含量的测定--考马斯亮蓝法 一 实验目的 1 掌握蛋白质提取的方法 2 学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度 二 实验原理 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是:(1)灵敏度高 (2)测定快速、简便,只需加一种试剂。(3)干扰物质少。此法的缺点是:由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。试剂与器材1.试剂:(1)标准蛋白质溶液牛血清清蛋白配制成0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。(2)考马斯亮兰G—250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G—250,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入10ml 85%的磷酸,至1升。2.器材:(1)可见光分光光度计(2)旋涡混合器(3)试管1支 操作方法1. 标准(1)取支试管,1支作空白,3支留作未知样品,每加完一管,立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见表中的第8、9、10管。2 加完试剂25分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。3 用标准蛋白(g/ml)为横座标,用吸光度值A595为纵座标,作图,即得到一条标准曲线。由此标准曲线,根据测出的未知样品的A595值,即可查出未知样品的蛋白质含量。(50m mol·L-1 pH7.5 的Tris-Hcl液;2 m mol·L-1 MgSO4; 2 m mol·L-1 EDTA; 5 m mol·L-1 β-巯基乙醇)于冰浴匀浆,8000 g离心10 min去除沉淀,上清溶液即是总可溶性蛋白质液。按标准曲线操作过程操作。测量OD值,从标准曲线查出蛋白质浓度。算出蛋白质含量。 五 作业 完成实验报告,写出实验小结。 酵母核糖核酸的分离和组分的鉴定 一、目的了解核酸的组分,并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、原理酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液,在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀,由此即得到RNA的粗制品。核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解,从水解液中可以测出上述组分的存在。三、器材1.乳钵2.150mL锥形瓶3.水浴4.量筒5.布氏漏斗及抽滤瓶6.吸管7.滴管8.试管及试管架9.烧杯10.离心机11.漏斗四、试剂和材料 1.0.04 mol/L氢氧化钠溶液2.酸性乙醇溶液将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中。3.95%乙醇4.5.1.5 mol/L硫酸溶液6.浓氨水7.0.1 mol/L硝酸银溶液8.氯化铁浓盐酸溶液将2mLl0%三氯化铁溶液(用FeCl3?6H2O配制)加入到400mL浓盐酸中。9.苔黑酚乙醇溶液溶解6g苔黑酚于100mL 95%乙醇中(可在冰箱中保存1个月)。 10.定磷试剂(1)17%硫酸溶液? 将17 mL浓硫酸(比重1.84)缓缓加入到83mL水中。(2)2.5%钼酸铵溶液? 将2.5g钼酸铵溶于100mL水中。(3)10%抗坏血酸溶液? 10 g抗坏血酸溶于100 mL水中,贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用,如呈深黄或棕色则失效,需纯化抗坏血酸。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。 17%硫酸溶液:2.5%钼酸铵溶液:10%抗坏血酸溶液:水=1:1:1:2(V/V)。11.酵母粉五、操作将15 g酵母悬浮于90 mL 0.04 mol/L氢氧化钠溶液中,并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后,冷却。离心(3 000r/min)15分钟,将上清液缓缓倾人30 mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾人。待核糖核酸沉淀完全后,离心(3000r/min)3分钟。弃去清液。用95%乙醇洗涤沉淀两次,洗涤沉淀一次后,再用将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。取200g提取的核酸,加入1.5 mol/L硫酸溶液10mL,在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定。1).嘌呤碱 取水解液1 mL加入过量浓氨水,然后加入约1 mL 0.1 mol/L硝酸银溶液,观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 2).核糖 取1支试管加人水解液1 mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2 mL。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色,说明核糖的存在。3)磷酸 取1支试管,加入水解液1 mL和定磷试剂I mL。在水浴中加热,观察溶液是否变成蓝色,说明磷酸是否存在。思 考 题 1.如何得到高产量RNA的粗制品? 2.本实验RNA组分是什么?怎样验证的?一、实验目的1了解脂肪酸的β-氧化; 2通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量,掌握测定β-氧化的方法及原理。 二、实验原理 根据β—氧化学说,机体组织能将脂肪酸氧化生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内,乙酰乙酸可脱羧生成丙酮,也可还原生成β-。乙酰乙酸、β-和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的中间产物。在正常情况下,其产量甚微;患糖尿病或食用高脂肪膳食时,血中酮体含量增高,尿中也能出现酮体。 本实验用新鲜肝糜与丁酸保温,生成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性的条件下,丙酮与碘生成碘仿。反应式如下:2NaOH+I2→NaIO+NaI+H2OCH3COCH3+3NaOI→CHI3+CH3COONa+2NaOH 剩余的碘,可用标准硫代硫酸钠滴定。NaOI+NaI+2HCl→I2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI 根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠之差,可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。 三、试剂与器材 恒温水浴、微量滴定装置、解剖用具、玻璃器皿等。 Locke氏溶液、0.1mol/L碘溶液、pH7.6,mol/L的磷酸缓冲液、 0.2mol/L丁酸溶液、15%三氯乙酸溶液、10%氢氧化钠溶液、10%盐酸溶液。 四、操作方法 处死动物→制备肝糜→丁酸氧化反应→碘仿反应→碘滴定 五、关键步骤与注意事项 用新鲜肝糜进行实验,确保肝内酶活力。 注意滴定终点的控制,保证实验的准确度。 六、思考题 1.为什么说脂肪酸β-氧化实验的关键是制备新鲜的肝糜? 2.什么叫酮体?为什么正常代谢时产生的酮体量很少? 过氧化物酶广泛存在于植物体中,是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高,幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素,增加木质化程度,而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加,所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外,过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。 通过本实验学习并掌握过氧化物酶活性测定的原理及方法。 二、原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应,产物为醌类化合物,此化合物进一步缩合或与其他分子缩合,产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚(即愈创木酚)为过氧化物酶的底物,在此酶存在下,H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚,其反应为: 红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值,即可求出该酶的活性。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1.? 水稻根系,马铃薯块茎等。 2.? (1)分光光度计 (2)移液管 (3)离心机(4 000r/min) (4)秒表 (5)研钵 (6)天平 3.药品 (1)0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5) 取12.114g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加水稀释,用HCl调pH8.5后定容1 000mL。 (2)0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0) 贮备液A:0.2 mol/L NaH2PO4溶液(27.8g NaH2PO4·H2O配成1 000mL)。 贮备液B:0.2 mol/L Na2HPO4溶液(53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O配成1 000mL)。 分别取贮备液A 87.7mL与贮备液B 12.3mL充分混匀并稀释至200mL。 (3)反应混合液 取0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL,过氧化氢0.028mL,愈创木酚0.019mL混合。 四、操作步骤 1.酶液提取:取不同水稻根系(根系表面水分吸干)1g,剪碎置于研钵中,加5mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5),研磨成匀浆,以4 000r/min离心5min,倾出上清液,必要时残渣再用5mL缓冲液提取一次,合并两次上清液,保存在冰箱(或冷处)备用。 2.取光径1cm比色杯2个,向其中之一加入上述酶液1mL(如酶活性过高可稀释之),再加入反应混合液3mL,立即开启秒表记录时间;而向另一比色杯中加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0),作为零对照。用分光光度计在470nm波长下测定反应5min时的光密度值。 五、结果计算 以每分钟光密度变化(以每分钟OD470nm变化0.01为1个活力单位)表示酶活性大小,即 过氧化物酶活力 = △OD470nm min·mg(FW) 六、附注 1.酶的提取纯化需在低温下进行。 七、思考题 1.试述酶活力的定义? 2.测定酶的活力要注意控制哪些条件? 参考答案 1.过氧化物酶活力是以每分钟光密度变化(OD470nm变化)0.01为1个活力单位来表示酶活性大小的。 2.酶的活力测定时:(1)保持待测材料的酶活;(2)测定时注意 氨基移换反应――血液中转氨酶活力的测定 一、实验目的: 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义,学习转氨酶活力测定的原理和方法。 二、实验原理: 生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶,能催化α-氨基酸的 α—氨基与α—酮基酸的α—酮基互换,在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4,它的种类甚多,其中以谷氨酸—草酸乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶)和谷氨酸—丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶)的活力最强。它们催化的反应如下。 正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎.心肌梗死等病患时,血清中转氨酶活力常显著增加,所以在临床诊断上转氨确活力的测定有重要意义。 测定转氨酶活力的方法很多,本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸和α—酮戊二酸后,生成的丙酮酸与2,4—二硝基苯肼作用生成丙酮酸2,4—二硝基苯腙。 丙酮酸2,4—二硝基苯腙加碱处理后呈棕色,可用分光光度法测定。从丙酮酸2,4—二硝基苯腙的生成量,可以计算酶的活力。 三实验器材: 1.试管及试管架。 2.吸管。 3.恒温水浴。 4.分光光度计。 四、试剂和材料: 1.0.1摩尔/升磷酸缓冲液(pH7.4) 250毫升 2.2.0微摩尔/毫升丙酮酸钠标准溶液 40一50毫升 取分析纯丙酮酸钠11毫克溶解于50毫升磷酸缓冲液内(当日配制)。 3. 谷丙转氨酶底物 150毫升 取分析纯α—酮戊二酸29.2毫克,DL—丙氨酸1.78克置于小烧杯内,加1当量/升氢氧化钠溶液约10毫升使完全溶解。用1当量/升氢氧化钠溶液或1当星/升盐酸调整pH至7.4后,加磷酸缓冲液至100毫升。然后加氯仿数滴防腐。此溶液每毫升含α-酮戊二酸2.0微摩尔,丙氨酸200微摩尔。在冰箱内可保存一周。 4.2.4—二硝基苯肼溶液 150毫升 在200毫升锥形瓶内放入分析纯2.4—二硝基苯肼19.8毫克加100毫升1当星/升盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动,待2,4—二硝基苯肼全部溶解后,滤人棕色玻璃瓶内,置冰箱内保存。 5.0.4当量/升氢氧化钠溶液 1,200毫升 6.人血清 五、实验操作: 1.标准曲线六个号。按下表所列的次序添加各试剂。 2,4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的α—酮戊二酸与2,4—二硝基苯肼反应,生成α—酮戊二酸苯腙。因此,在制作标准曲线时,须加入一定量的底物(内含α—酮戊二酸)以抵消由α—酮戊二酸产生的消光影响。 先将试管置于37℃恒温水浴中保温10分钟以平衡内外温度。向各管内加入0.5毫升2,4—二硝基苯肼溶液后再保温20分钟,最后,分别向各管内加入0.4当量/升氢氧化钠镕液5毫升。在室温下静置30分钟,以0号管作空白,测定520毫微米的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标,光吸收值为纵坐标,画出标准曲线号试管做为空白对照管。各加入谷丙转氨酶底物0.5毫升,置于37℃水浴内10分钟,使管内外温度平衡。取血清0.1毫升加到第l号试管内,继续保温60分钟。到60分钟时,向两支试管内各加入2,4—二硝基苯肼试剂0.5毫升,然后再向第2号试管中加入0.4当量/升氢氧化钠溶液5毫升。在室温下静置30分钟后,测定未知管的520毫微米波长光吸收值(显色后30分钟至2小时内其色度稳定)。在标准曲线上查出丙酮酸的微摩尔效。(用1微摩尔丙酮酸代表1.0单位酶活力)。计算每100毫升血清中转氨酶的活力单位数。 凝胶过滤法测定蛋白质相对分子量 一 实验目的 学习用葡聚糖凝胶过滤法测定蛋白质的分子量。 二 实验原理 葡聚糖凝胶(Sephadex)过滤法测定蛋白质分子量的原理,主要是依据这种凝胶具有分子筛作用,一定型号的凝胶具有大体上一定大小的孔径。在一定的凝胶柱内,凝胶孔隙所占的体积成为内水体积Vi,凝胶颗粒间的自由空间所占的体积称为外水体积V0。当样品流经凝胶柱时,大于孔隙的大分子完全不滲入到凝胶内部,只需V0体积的洗脱液便可将其由一端洗脱到另一端;相反,如果样品体积小于孔隙,则需要V0+Vi体积的洗脱液,才能将它们由一端洗脱到另一端。中等分子(分子大小在上述两种极限之间)所需洗脱液体积介于两者之间,Ve=V0+KdVi(0Kd1)。 Kd为分配系数,它表示一种物质在孔隙内的滲透程度,相当于这种物质在孔隙内所占体积和孔隙总体积的比值。 如果假定蛋白质分子近于球形,同时没有显著的水合作用,则不同大小分子量的蛋白质,进入凝胶筛孔的程度不同,其洗脱体积决定于分子大小。当蛋白质分子量在10000~15000时,蛋白质在葡聚糖凝胶柱上层析的洗脱体积和分子量的对数呈直线关系。若用已知分子量的标准蛋白质在一定型号葡聚糖凝胶柱上层析,精确测其洗脱体积,并以洗脱体积Ve对分子量的对数logMW作图,可获得一条标准曲线。未知分子量的蛋白质在相同条件下层析,根据其洗脱体积即可在标准曲线上求得分子量。 本方法测分子量设备简单,结果处理方便,因此应用较广泛。但本方法仅适用于轴比相近似为球状蛋白,对轴比大的纤维蛋白不适用;对含量大于5%的糖蛋白因有较大水合作用,测得分子量偏高;对含铁蛋白测定数据偏低。 由于Ve与柱的大小有关,如果用Ve/V0对logMW作图,同样可得一线性关系的标准曲线,且可消除柱的大小和吸附效应的误差。 三 实验试剂和器材 试剂 :洗脱液:0.05M Tris-HCl缓冲液,pH7.5,0.1M KCl溶液:称取12.12g Tris,15g KCl,先用少量无离子水溶解,再加入6.67ml浓HCl,水定容至2L。 蓝色葡聚糖2000;Sephsdex G-100;N-乙酰酪氨酸乙酯饱和溶液(以洗脱液饱和)。 器材:牛血清白蛋白;卵清蛋白;细胞色素c;核糖核酸酶;层析柱;紫外检测仪;自动分部收集器。 四 实验步骤 1 溶胀凝胶 取Sephadex G-100 15g,加500ml蒸馏水室温溶胀三天(或沸水浴中溶胀5小时)。待溶胀平衡后,倾去上层清液,包括细颗粒,然后再放些蒸馏水搅乱,静置使凝胶下沉,再倾去上层清液,至无细颗粒为止。溶胀平衡和漂洗净的凝胶经减压抽气除去气泡,即可准备装柱。 2 装柱 取2.6×60cm层析柱一根,底部用玻璃纤维或砂蕊滤板衬托,并要求滤板下的体积尽可能小(否则被分离的组份间重新混合的可能性就大,其结果影响层析的灵敏度,降低分离效果)。在砂蕊滤板上覆盖一张大小与柱的内径相当的快速滤纸片。将柱垂直至于铁架上,然后在柱顶通过橡皮塞连接一长颈漏斗(漏斗颈直径约为柱直径的一半)。在柱中加水或洗脱液,并赶净滤板下方气泡,使支持滤板底部完全充满液体,然后将柱的出口关闭。把已经溶胀好的凝胶调成薄浆,从漏斗倒入柱内,胶粒逐渐扩散下沉,薄浆连续加入。当沉积的胶床至2~3cm高时,打开柱的出口,并注意控制操作压以均匀不变的流速直到胶装完为止。柱装好后,在床的上面盖上一张大小略小与柱内径的滤纸片,以防止样品中一些不溶物质混入床中。再以洗脱液平衡柱层,直至层析的胶床高不变为止。柱装得是否均匀,可用蓝色葡聚糖上柱检验;如果色带均匀下移,说明柱子已装好,可以使用。层析柱的流速可借操作压即进出口液面的高度差来控制。凝胶床受操作压的影响极为明显。增加操作压虽能增加流速,但时间长久后,凝胶被压紧反而使流速减慢。各类凝胶能耐受的最大压力如下表所示: 型号 压力极限(毫米汞柱) G-200 10 G-180 35 G-75 50 G-50~G-10 100 3上样 称取0.5mg蓝色葡聚糖2000(分子量200万以上)四份,分别放在称量瓶中,再称取标准蛋白牛血清白蛋白(分子量68000),卵清蛋白(分子量43000),核糖核酸酶(分子量13700),细胞色素c(分子量11700)各10mg,分别放在各称量瓶中;各瓶加入N-乙酰酪氨酸乙酯饱和溶液0.5ml,使混合物溶解后分别上柱。 样品上柱是实验成败的关键之一,若样品稀释或上柱不均,会使区带扩散,影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口,待柱中洗脱液流至距床表面1~2mm时,关闭出口,用滴管将样品慢慢地加至柱床表面,打开出口并开始计算流出体积,当样品滲入床中接近床表面1mm时关闭出口,同时加样品时一样小心地加入少量洗脱液,再打开柱的出口,使床表面的样品也全部滲入柱内。这时样品已加好,在床的表面再小心地加洗脱液,使高出床表面3~5cm,接上恒压洗脱瓶,调节操作压在30cmH2O以内。 4收集和鉴定 层析开始,在柱的出口处以试管分管收集流出液(开始时可用量筒,至80ml以后开始4ml/管分管收集),收集液在751分光光度计280nm处测OD值。最高的一个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积Ve。当N-乙酰酪氨酸乙酯洗脱峰出现后(此峰洗脱体积不必记录);按同样的方法进行第二个标准蛋白质样品的上柱,操作方法和步骤同前。 将各标准蛋白质测得的洗脱体积Ve对它们的分子量对数作图,则应获得一线性的标准曲线 根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后住床容积,计算所需凝胶干粉的重量,以将用作洗脱剂的溶液使其充分溶胀。 2 层析柱粗细必须均匀,柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说,细长的柱分离效果较好。若样品量多,最好选用内径较粗的柱,但此时分离效果稍差。柱管内径太小时,会发生“管壁效应”,即柱管中心部分的组份移动慢,而管壁周围的移动快。柱越长,分离效果越好,但柱过长,实验时间长,样品稀释度大,分离效果反而不好。 对于脱盐的柱一般都是短而粗,柱长(L)/直径(D)(10;对分级分离用的柱,L/D值可以比较大,对很难分离的组份可以达到L/D=100,一般选用内径为1cm,柱长100cm就够了。 3 各接头不漏气,连接用的小乳胶管不要有破损,否则造成漏气、漏液。 4 装柱要均匀,不要过松也不要过紧,最好也在要求的操作压下装柱,流速不宜过快,避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢,使柱装得太松,导致层析过程中,凝胶床高度下降。 5 始终保持柱内液面高于凝胶表面,否则水分挥发,凝胶变干。 五 作业 完成试验报告。 根据实验中遇到的各种问题,总结做好本实验的经验与教训? 聚丙烯酰胺电泳分离同工酶 一 实验目的 了解同工酶研究在理论和实践中的重要意义。同工酶是指能催化同一种化学反应,但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。研究表明,植物在发育过程中,所含同工酶的种类和比例都不相同,它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系,因此作为基因表达的产物,测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具,在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化,测定这种酶的活性或其同工酶,可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶,方法简便,灵敏度高,重现性强,测定结果便于观察、记录和保存。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术,分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶,根据酶的生物化学反应,通过染色方法显示出酶的不同区带,以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。 通过本实验要掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识,熟悉主要的操作过程,同时对同工酶有一个感性的认识。 1.电泳带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动,这种现象称为电泳。近几十年来,电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快,在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子,有较高的分辨率,目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。 2.影响电泳的主要因素 若将带净电荷q的粒子放入电场,则该粒子所受到的引力F引可用数学式表示如下: F引=E·q(1)式中E为电场强度,单位为“v/cm”,表示电场中单位距离上的电位差。如果这种情况发生在真空中,则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。但在溶液中,由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力(即摩擦力)F阻 相对抗。故上述现象不会发生。根据Stokes公式,阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度: F阻 =6πrηv (2)式中F阻 是球形粒子所受的阻力,r是球形粒子的半径,η是溶液的粘度,v是粒子移动的速度。在溶液中,由电场而产生的加速力被阻力所对抗,因此, E·q=6πrηv (3) 将(3)式整理得:V= E·q6πrη (4), 由此可以看出,粒子移动的速度(v)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(q)成正比,而与粒子的大小(r)和溶液的粘度(η)成反比。非球形粒子(如DNA)在电泳过程中会受到更大的阻力,即粒子的移动速度还与粒子形状有关。 既然在一定pH条件下,每一分子都具有特殊的电荷(种类与数量)、大小和形状,在一定的时间内它在相同的电场中便应集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析、鉴定的基本原理。 由于带电粒子的泳动速度受电场强度影响,使得同一带电粒子在不同电场里泳动速度不同。为了便于比较,常用迁移率(或称泳动度)代替泳动速度表示粒子的泳动情况。迁移率(泳动度)的定义为“带电粒子在单位电场强度下的泳动速度”,若以m表示迁移率,则 m= v (5) E 将(4)式代入(5)式,得 ??????????????????? m= E·q ? q (6) 6πrη = E 6πrη 由(6)式可以看出,迁移率(泳动度)仅与球形粒子所带电荷的数量,粒子大小及溶液粘度有关,而与电场强度无关。由于氨基酸、蛋白质、酶等的电离度a随溶液pH变化而不同,所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率u为迁移率m和当时条件下电离度a的乘积。即: u=m·a (7) 将(6)式代入(7)式,得: u= q·a (8) 6πrη 由(8)式可以看出,凡能影响溶液粘度η的因素如温度,影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变,都会对有效迁移率产生影响。因此,电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时,所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好,以利于分离各种成分。 以上讨论的基本上是在溶液中进行的自由电泳的情况。在支持介质中进行的各种电泳,除以上因素影响外,有效迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中,液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中,由于滤纸(纤维素)上带有负电荷,因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷,从而使液体向负极移动,带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此,电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。 最后要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般最适的离子强度在0.02~0.2之间。在稀溶液中,离子强度Ⅰ可用下式计算: Ⅰ= 1 ΣmiZi2 (9) 2 (9)式中,mi为离子的克分子浓度,Zi为离子的价数。 3.聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体(Acrylamide,简写为Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-Methylena Bisacrylamide,简写为Bis)在催化剂的作用下聚合而成的。 Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的,且具有神经毒性,操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时,它们聚合。引发产生自由基团的方法有两种,即化学法和光化学法。化学聚合的引发剂是过硫酸铵 (NH4)2S2O3(Ammonium persulfate,简写为Ap),催化剂是N,N,N,N-四甲基乙二胺(Tetramethylenediamine,简写为TEMED)。在催化剂TEMED的作用下,由过硫酸铵(Ap)形成的自由基又使单体形成自由基,从而引起聚合作用。TEMED在低pH时失效,会使聚合作用延迟;冷却也可使聚合速度变慢;一些金属抑制聚合;分子氧阻止链的延长,防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。 光聚合以光敏感物核黄素(即VB2)作为催化剂,在痕量氧存在下,核黄素经光解形成无色基,无色基被氧再氧化成自由基,从而引起聚合作用。过量的氧会阻止链长的增加,应避免过量氧的存在。 光聚合形成的凝胶孔径较大,而且随着时间的延长而逐渐变小,不太稳定,所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。采用化学聚合形成的凝胶孔径较小,而且重复性好,常用来制备分离胶。 聚丙烯酰胺的基本结构,为丙烯酰胺单位构成的长链,链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链的纵横交错,形成三维网状结构,使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动,使凝胶具有良好的抗对流作用。此外,长链上富含酰胺基团,使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷,在电场中电渗现象极为微小。这些特点,使得聚丙烯酰胺适合作区带电泳的支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100ml凝胶溶液中含有的单体(Acr)和交联剂(Bis)总克数称为凝胶浓度,用T%表示。凝胶溶液中,交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis)总量的百分数称为交联度,用C%表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质,而用2.4%的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同,适用的浓度也不同(见表1)。 表1 凝 胶 浓 度 选 用 表 物质 分 子 量 范 围 适用的凝胶浓度(%) 蛋 白 质 <104 20~30 1×104~4×104 15~20 4×104~1×105 10~15 1×105~5×105 5~10 >5×105 2~5 核酸 <104 15~20 104~105 5~10 105~2×106 2~2.6 4.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 系统的不连续性表现在以下几个方面: (1)凝胶板由上、下两层胶组成,两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶,下层为小孔径的分离胶。 (2)缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液,浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 (3)在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里,存在三种物理效应,即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下,待测物质被很好地分离开来。下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例,分别说明三种效应的作用: (1)电荷效应:各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量,在电场作用下向一定电极,以一定速度泳动。 (2)分子筛效应:分子量小,形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小,移动较快;反之,分子量大、形状不规则的分子,电泳过程中受到的阻力较大,移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。 (3)浓缩效应:待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层,而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下: ① 由于两层凝胶孔径不同,酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时,阻力突然加大,速度变慢。使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄,浓度升高。 ② 在聚丙烯酰胺凝胶中,虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液,但上层浓缩胶为pH 6.7,下层分离胶为pH 8.9。HCl是强电解质,不管在哪层胶中,HCl几乎都全部电离,Cl-布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在样品槽中,浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始,有效泳动率最大的Cl-迅速跑到最前边,成为快离子(前导离子)。在pH6.7条件下解离度仅有0.1~1%的甘氨酸(pI = 6.0 )有效泳动率最低,跑在最后边,成为慢离子(尾随离子)。这样,快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白,其有效泳动率介于快慢离子之间,被夹持分布于界面附近,逐渐形成一个区带。 由于快离子快速向前移动,在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区,即低电导区。因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系: V= I S 所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进,追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带,在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中,各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次,在进入分离胶前被初步分离,形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。 当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后,pH从6.7变为8.9,甘氨酸解离度剧增,有效迁移率迅速加大,从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时,快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前,不连续的高电位梯度不再存在。于是,此后的电泳过程中,酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下,仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比,不连续系统的分辨率大大提高,因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。 1.实验材料 小麦幼苗 2.仪器 (1)垂直板电泳槽及附件(玻璃板、硅胶条、梳子、导线)稳压稳流直流电泳仪 (3)高速离心机(10 000r/min) (4)量筒:500mL×1,10mL×1,5mL×1 (5)烧杯:250mL×4 (6)微量注射器(50μL) (7)其他:玻棒、大培养皿等 2.试剂 贮液配制方法见表2。 表2 聚丙烯胺凝胶电泳贮液配制方法 序号 试 剂 名 称 配 制 方 法 1 1.5%琼脂 1.5g琼脂,100mL pH8.9分离胶缓冲液浸泡,用前加热溶化。 2 分离胶缓冲液,pH8.9 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液) 取48 mL 1mol/L HCl,Tris36.8g,用无离子水溶解后定容至100 mL。 3 浓缩胶缓冲液,pH6.7 (pH6.7 Tris-HCl缓冲液) 取48 mL 1 mol/L HCl,Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100 mL。 4 分离胶丙胶贮液 (Acr-Bis贮液Ⅱ) Acr 28.0g,Bis 0.735g,用无离子水溶解后定容至100 mL,过滤除去不溶物,装入棕色试剂瓶,4℃保存。 5 浓缩胶丙胶贮液 (Acr-Bis贮液Ⅰ) Acr 10g,Bis 2.5g,用无离子水溶解后定容至100 mL,过滤除去不溶物,装入棕色试剂瓶,4℃保存。 6 10%过硫酸铵溶液(Ap) 10g过硫酸铵溶于100 mL无离子水中(当天配制)。 7 四甲基乙二胺(TEMED) 原液。 8 核黄素溶液 核黄素4.0mg,无离子水溶解后定容至100mL。 9 电极缓冲液,pH8.3 (pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) Tris 6 g,甘氨酸28.8 g,溶于无离子水后定容至1 000 mL,用时稀释10倍。 10 40%蔗糖溶液 蔗糖40 g,溶于100 mL无离子水中。 11 pH4.7乙酸缓冲液 乙酸钠70.52 g,溶于500 mL蒸馏水中再加36 mL冰乙酸,蒸馏水定容至1 000 mL。 12 7%乙酸溶液 19.4 mL 36%乙酸稀释至100 mL。 13 样品提取液,pH8.0 (pH8.0 Tris-HCl缓冲液) Tris 12.1 g,加无离子水1 000 mL,以HCl调节pH至8.0 14 0.5%溴酚蓝溶液 0.5 g溴酚蓝溶于100 mL无离子水中。 15 联大茴香胺染色液 联大茴香胺250 mg溶于140 mL 95%乙醇中,加20 mL蒸馏水,使用前加3%H2O2 4~5 mL(当天配制) 1.贮液配制 按上表配制贮液,但应注意 (1)配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存,可放1~2个月。 (2)过硫酸铵应当天配制。 (3)如有不溶物要过滤。 (4)显色液用前再混和。 (5)电极缓冲液用时稀释10倍。 2.电泳槽的安装 垂直板电泳槽的式样很多,目前流行的是用有机玻璃做的两个“半槽”组成的方形电泳槽,中间夹着凝胶模子,是由成套的两块玻璃板装入一个用硅酮橡胶做成的模套而构成,由硅酮橡胶套决定两玻璃板之间距离约为1.5mm,形成一个“胶室”,胶就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶。当凝胶模子与两半槽固定在一起后,凝胶槽子两侧形成前后两个槽,供装电极缓冲液和冷凝管用。 将两块玻璃板用去污剂洗净,再用蒸馏水冲洗,直立干燥(勿用手指接触玻璃板面,可用手夹住玻璃板的两旁操作),然后正确放入硅胶条中,夹在电泳槽里,按对角线顺序旋紧螺丝,注意用力均衡以免夹碎玻璃板。安装好电泳槽用pH8.9缓冲液配制的1.5%琼脂溶液封底,待琼脂凝固后即可灌制凝胶。 3.凝胶的制备 将贮液由冰箱取出,待与室温平衡后再配制工作液。 (1)按表3比例配制分离胶 将分离胶沿长玻璃板加入胶室内,小心不要产生气泡,加至距短玻璃板顶端3cm处,立即覆盖2~3mm的水层(或水饱和正丁醇),静置待聚合(约40min),当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。 (2)按表4比例配制浓缩胶 注:TEMED在灌胶前加。 先倒掉分离胶上的水层,立即加入浓缩胶,插入梳子(即样品槽模板),待胶凝后,小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中,前槽(短板侧)缓冲液要求没过样品槽,后槽(长板侧)缓冲液要求没过电极,备用。 4.样品的制备 称取小麦幼苗茎部0.5 g,放入研钵内,加pH 8.0提取液1 mL,于冰水浴中研成匀浆,然后以2 mL提取液分几次洗入离心管,在高速离心机上以8 000r/min离心10min,倒出上清液,以等量40%蔗糖及1/5体积溴酚蓝指示剂混和,留作点样用。 5.点样 用微量注射器(50μL)吸取少量样液,在浓缩胶上层点样,每个点样槽15~50μL。点样时须小心,防止样品液的扩散。 6.电泳 将电泳槽放入冰箱,接好电源线(前槽为负极)。打开电源开关,调节电流到20mA左右,样品进入到分离胶后加大到30mA,维持恒流。待指示染料下行到距胶板末端1cm处,即可停止电泳。把调节旋扭调至零,关闭电源,电泳约3h。 7.剥胶 取出电泳胶板,去掉胶套,掀开玻璃,去掉浓缩胶,用玻棒协助将分离胶放到盛有pH4.7的乙酸缓冲液的大培养皿中浸泡10min。 8.染色、记录结果 倒去乙酸缓冲液,加联大茴香胺染色液,使淹没整个胶板,于室温下显色20min,即得到过氧化物酶同工酶的红褐色酶谱。该酶活性染色过程如下:过氧化物酶分解H2O2产生氧基,后者使联大茴香胺发生反应生成褐色化合物。所以用染色液浸泡凝胶时,有过氧化物酶同工酶蛋白质条带的部位便出现褐色的谱带。 倒掉染色液,重新加入7%的乙酸溶液,于日光灯下观察记录酶谱,绘图或照相。 五、附注 1.如果室温较高,可适当减少电流,延长电泳时间,或采取降温措施,以免温度过高造成酶活损失。 2.工业纯丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)的纯化方法 (1)Acr的纯化 称取70g的Acr,于50℃溶于1 000L三氯甲烷(A.R.)中,趁热过滤,冷至-20℃,使结晶,于冷处用布氏漏斗抽滤,用冷的三氯甲烷短时间冲洗,继续抽滤,收集结晶,在真空干燥器中彻底干燥。将白色纯结晶保存于棕色瓶中,熔点为84.5±0.3℃。 (2)Bis的纯化 称取12g的Bis溶于40~50℃的1 000L丙酮(A.R.)中,趁热过滤,慢慢冷至-20℃,于冷处过滤或离心收集结晶。用冷丙酮洗涤后,真空干燥。白色结晶保存于棕色瓶中。 1.电泳要求的基本条件有哪些? 2.丙烯酰胺凝胶电泳的制胶过程中,哪些因素影响胶的凝聚? 参考答案 1.电泳的基本条件为:(1)电泳应尽可能在恒温条件下进行。(2)选用一定pH的缓冲液。同时,所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好,以利于分离各种成分。(3)有效迁移率还受电渗现象的影响,电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。(4)选用离子强度适宜的溶液。一般最适的离子强度在0.02~0.2之间。 2.TEMED在低pH时失效,会使聚合作用延迟;冷却也可使聚合速度变慢;一些金属抑制聚合;分子氧阻止链的延长,防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。以光敏感物核黄素(VB2)作为催化剂进行光聚合时,应避免过量氧的存在。 3.系统的不连续性表现在以下几个方面:(1)凝胶板的上、下两层凝胶的孔径不同,上层为大孔径的浓缩胶,下层为小孔径的分离胶。(2)缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液,浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。(3)在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里,存在三种物理效应,即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下,待测物质被很好地分离开来。 4.该酶活性染色过程如下:过氧化物酶分解H2O2产生氧基,后者使联大茴香胺发生反应生成褐色化合物。所以用染色液浸泡凝胶时,有过氧化物酶同工酶蛋白质条带的部位便出现褐色的谱带。 66 Ve 对log MW 作图 1. 细胞色素c 2. 核糖核酸酶 3. 肌红蛋白 4. α-胰凝乳蛋白酶 5. 胰蛋白酶 6. 胃蛋白酶 7. 过氧化物酶 8. 卵清蛋白 9. 血清白蛋白 10. 铁蛋白 Ve / V0对log MW作图

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